ПНИЭР «Разработка новых терапевтических VHH-антител к рецептору HER3
по Соглашению о предоставлении субсидии от «03» октября 2016 г. № № 14.577.21.0217 с Минобранауки России
(Уникальный идентификатор ПНИЭР RFMEFI57716X0217)
Целью ПНИЭР является разработка новых высокоаффинных VHH-антител к аномально экспрессируемому в злокачественных опухолях рецептору HER3 на основе структуры комплекса внеклеточного домена HER3 с ранее найденным VHH-антителом с применением методов молекулярного моделирования.
Объектами исследования являются уникальное прототипное однодоменное VHH антитело к участку внеклеточного домена человеческого рецептора HER3 и участок внеклеточного домена человеческого рецептора HER3.
На 1-м этапе ПНИЭР был проведен аналитический обзор информационных источников по изучаемой проблеме и патентные исследования с целью оценки технического уровня объектов разработки, которые показали, что разработка новых высокоаффинных VHH-антител к аномально экспрессируемому в злокачественных опухолях рецептору HER3 является наукоемкой задачей, имеющей высокую практическую значимость в медицинском применении. Проводимые в рамках настоящего проекта ПНИЭР исследования являются логическим продолжением наиболее современных работ в этой области и позволят создать уникальные отечественные терапевтические антитела для лечения онкологических заболеваний. Были исследованы, обоснованы и выбраны методы и средства, направления исследований и способы решения поставленных задач. В частности, были выбраны подходы и методы создания генетических конструкций, кодирующих прототипное VHH-антитело и участок внеклеточного домена рецептора HER3, для экспрессии данных белков в прокариотических и эукариотических системах. Были исследованы различные методы хроматографической очистки белков. Были выбраны и обоснованы направления физико-химических исследований прототипного VHH-антитела, обоснован выбор подходов к кристаллизации данного белка и разработаны экспериментальные процедуры кристаллизации. Были выбраны и детально проработаны подходы к съемке и математической обработке дифракционных данных. Были проведены предварительные генно-инженерные работы по созданию генетических конструкций на основе векторов pET22 и pSol, кодирующих целевые белки. Были экспериментально отработаны подходы и методы выделения и очистки целевых белков в двух различных системах экспрессии.
На 2-м этапе ПНИЭР были проведены генно-инженерные работы и созданы 6 различных генетических конструкций для экспрессии прототипного VHH-антитела (3 варианта) и участка внеклеточного домена рецептора HER3 (3 варианта) в эукариотических клетках CHO и различных штаммах бактерий E. coli. Были экспериментально протестированы различные способы культивации клеточных культур и найдены оптимальные режимы экспрессии для получения максимального количества функционального белка. Для каждого из исследуемых белков были разработаны протоколы выделения и очистки при помощи методов металл-хелатной хроматографии, высокоразрешающей ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Были проведены выделение и очистка целевых белков и получены пробы не менее 50 мг для дальнейших структурно-функциональных исследований. Были проведены дополнительные патентные исследования, показавшие новизну и высокую практическую значимость разработанной VHHсистемы экспрессии однодоменных антител. В результате работы были всесторонне изучены физико-химические свойства прототипного VHH-антитела и участка внеклеточного домена рецептора HER3. В частности, вторичная структура белков была исследована методом кругового дихроизма, а их конформационная стабильность была изучена методами дифференциальной сканирующей калориметрии и спектроскопии триптофановой флуоресценции. Методом поверхностного плазмонного резонанса была определена аффинность прототипного 
VHH-антитела к участку внеклеточного домена рецептора HER3 и получена константа диссоциации для моновалентного связывания 1 мкМ. Был проведен поиск условий кристаллизации прототипного VHH-антитела, в результате которого VHH-антитело было кристаллизовано в двух различных формах. Были проведены измерения рентгеновской дифракции полученных кристаллов и математическая обработка дифракционных данных. В результате обработки данных были получены 2 атомарные структуры высокого разрешения, 1.6 и 1.9 Å, схематичное изображение одной из которых представлено на рис. 1. Структуры были депонированы в PDB (6EZW, 6F0D), а также использованы для проведения предварительных работ по молекулярному моделированию структуры комплекса рецептора HER3 и прототипного VHH-антитела.
Рисунок 1. Структура прототипного VHH-антитела с разрешением 1.6 Å (PDB:6EZW). Цветом отмечен паратоп связывания с HER3: CDR Н1 (оранжевый), H2 (синий) и H3 (красный).
На 3-м этапе ПНИЭР проведено молекулярное моделирование структуры комплекса рецептора HER3 и прототипного VHH-антитела на основе полученных данных рентгеновской кристаллографии и сконструированы первичные последовательности новых VHH-антител к рецептору HER3. Два кандидата отобраны для дальнейших углубленных экспериментальных исследований. Для каждого из новых кандидатных VHH-антител проведены генно-инженерные работы и созданы две системы экспреcсии: система для цитоплазматической прокариотической экспрессии в клетках E. coli Shuffle с использованием векторов pSol и система для секреционной эукариотической экспрессии в клетках CHO-T с использованием векторов pcDNA. Экспериментально протестированы различные способы культивации клеточных культур и найдены оптимальные режимы экспрессии для получения максимального количества функциональных VHH-антител. Для каждого из новых VHH-антител разработаны протоколы выделения и очистки при помощи методов металл-хелатной хроматографии, высокоразрешающей ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Созданные кандидатные VHH-антитела выделены и очищены, в результате чего получены пробы не менее 100 мг для дальнейших функциональных исследований и исследовательских испытаний. Проведены дополнительные патентные исследования, показавшие новизну и патентопригодность созданных VHH-антител к рецептору HER3. Разработана Программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов VHH-антител к рецептору HER3. В соответствии с разработанной Программой проведены исследовательские испытания, показавшие соответствие созданных VHH-антител требованиям Технического задания. На рис. 2 представлен пример кривой связывания с рецептором, демонстрирующий высокую аффинность созданных VHH-антител. Разработаны Лабораторный технологический регламент создания VHH-антител к рецептору HER3, Технико-экономическое обоснование разработки продукции с учетом технологических возможностей Индустриального партнера, а также проект технического задания на выполнение опытно-технологических работ по теме:
«Разработка опытно-промышленного регламента создания терапевтических VHH-антител к рецептору HER3». Подготовлены рекомендации по дальнейшему использованию научных и научно-технических результатов выполнения ПНИЭР, включающие применение созданных VHH-антител для фундаментальных исследований механизма активации и ресайклинга рецептора HER3, практическое применение VHH-антител в составе систем для диагностики онкологических заболеваний, и практическое применение VHH-антител в виде моно- и биспецифических терапевтических антител.
Рисунок 2. Кривая связывания созданного VHH-антитела с рецептором HER3 (KD ~ 1 нМ).
Совместно с Индустриальным партнером ЗАО «Биокад» было произведено материально-техническое обеспечение работ. При выполнении работ были использованы передовые технологии и экспериментальные подходы, что обуславливает высокий научный уровень. Запланированные на 2-м этапе аналитические, теоретические и экспериментальные работы были выполнены в полном объеме в соответствии с Планом-графиком исполнения обязательств и условиями Технического задания Соглашения. Все требования по достижению значений показателей результативности предоставления субсидии были выполнены в полном объеме.